Page 112 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

cu o soluţie apoasă la temperatură înaltă. Proba procesată, ce include biluţele de sticlă împreună cu
ADN VHB şi ADN VHB QS, va fi adăugată amestecului de amplificare şi transferată în analizorul în
care vor avea loc amplificarea şi detecţia .
4
În cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se face în prezenţa unui sistem raportor care emite
fluorescenţă. Detecţia se realizează cu ajutorul sondelor de tip 5’ nuclează - sonde TaqMan, dublu
marcate: la un capăt cu o substanţă fluoroforă (“reporter dye” R) şi la celălalt capăt cu o moleculă
blocantă (“quencher dye” Q). Cât timp sonda este intactă, fluorescenţa sistemului R va fi inhibată de
molecula Q. În cazul în care amplificarea este eficientă, moleculele de ADN nou formate vor fixa prin
hibridizare sonda TaqMan; în cursul etapei de elongaţie, ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin
activitatea sa enzimatică de 5’ endonuclează şi va elibera astfel fluoroforul (vezi fig.5.6.1.3) .
5;7
Fig. 5.6.1.3
Metoda de detecĠie a fluorescenĠei
M e toda de dete c Ġ i e a f l u o r e s c e n Ġ ei
a
T
Taqman n
q
a
m
R R Q Q

a
T Taq q

Energia emisă de fluorofor în urma excitării în UV va fi înregistrată la sfârşitul fiecărui ciclu de
amplificare, fiind proporţională cu cantitatea de ADN ţintă prezentă în tub până în momentul respectiv .
7
Sondele HBV şi HBV QS sunt marcate cu fluorofori R diferiţi, permiţând înregistrarea independentă
a emisiilor lor . Înregistrările sunt folosite pentru generarea unei curbe de amplificare cu 3 regiuni: o
4
regiune de latenţă în care acumularea de ADN nu atinge încă punctul limită de detecţie a semnalului;
o regiune de amplificare exponenţială şi o regiune de platou, în care amplificarea secvenţei ţintă
încetează în special datorită epuizării enzimei şi inhibiţiei prin cantitatea mare de ADN . Cu cât este
7
mai mare titrul de ADN VHB din probă, cu atât mai devreme fluorescenţa emisă se va ridica deasupra
nivelului bazal de fluorescenţă (vezi fig.5.6.1.4) .
4

112