Page 114 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

În cazul determinării încărcăturii virale C plasmatice se utilizează tehnica RT-PCR (reverse-
transcriptase PCR) care a fost dezvoltată pentru amplificarea ţintelor ARN. Procesul se desfăşoară
într-un mod similar celui de determinare a viremiei B, dar se adaugă şi etapa de transcriere inversă
a ARN-ului ţintă pentru a genera ADN-ul complementar (ADNc). Această etapă este realizată tot de
ADN polimerază, ceea ce permite ca atât transcrierea inversă cât şi amplificarea PCR să se producă
împreună, cu detecţia în timp real a ampliconului .
4
Analiza mutaţiei factorului V (FV Leiden)
Metoda permite detectarea şi genotiparea unei mutaţii punctiforme a genei umane care codifică
factorul V. Prin intermediul unor primeri specifici se asigură amplificarea unui fragment ADN ţintă din
gena factorului V, izolat printr-o tehnică automată dintr-o probă de sânge integral.
Pentru efectuarea testului se utilizează sistemul PCR LightCycler care foloseşte o detecţie în timp
real prin fluorescenţă a produsului amplificat diferită de cea obţinută cu ajutorul sondei TaqMan.
Astfel, pentru detecţia ampliconului se folosesc 2 sonde care hibridizează la o secvenţă internă a
fragmentului amplificat, în cursul fazei de hibridizare a primerilor. Sondele sunt reprezentate de 2
secvenţe oligonucleotidice specifice, marcate cu fluorofori diferiţi:
- sonda 1, marcată la capătul 3’ cu fluoresceină (fluoroforul donator D);
- sonda 2, marcată la capătul 5’ cu substanţa LightCycler Red 640 (fluoroforul acceptor A).
Secvenţele celor 2 sonde sunt astfel selectate încât să hibridizeze la secvenţele ţintei într-un aranjament
de tip cap-coadă, facilitând apropierea celor 2 fluorofori. Fluoresceina este excitată de lumina albastră
emisă de o sursă a LightCycler-ului şi emite o lumină fluorescentă verde. Ca urmare a apropierii celor
2 fluorofori în cursul fazei de hibridizare, energia emisă excită la rândul său fluoroforul Red 640, printr-
un transfer de energie a rezonanţei fluorescente (FRET: fluorescence resonance energy transfer - vezi
fig.5.6.1.6 ); acesta va emite o lumină fluorescentă roşie, a cărei intensitate va fi măsurată în unitatea
optică a LightCycler-ului. Cantitatea de fluorescenţă emisă va fi proporţională cu nivelul ţintei .
4;7
Fig.5.6.1.6

Metoda de
detecĠie a
fluorescenĠei
Light cycler
D
A

114