Page 118 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

sau a intensificatorilor („enhancers”) pot determina alterarea reglării transcripţiei, variaţii ale produşilor
de splicing ARNm sau a secvenţelor de aminoacizi.
Cele mai multe dintre aceste variaţii se caracterizează prin modificări ale unei singure baze azotate
denumite polimorfisme nucleotidice unice („single nucleotide polymorphisms” = SNPs).
Proprietatea de recunoaşterea a unor secvenţe specifice de către enzimele de restricţie a fost utilizată
încă din anii ’70 pentru detecţia SNPs. Enzimele de restricţie sunt endonucleaze bacteriene care
recunosc secvenţe specifice scurte de perechi de baze şi clivează molecula de ADN numai la nivelul
situsului de recunoaştere. Un astfel de exemplu este enzima EcoRI izolată de la E. coli (vezi figura
5.6.1.9):

GAATTC

EcoRI
CTTAAG

Fig. 5.6.1.9 Enzima de restricţie EcoRI şi specificităţile acesteia

Cu ajutorul acestor enzime a fost dezvoltată o metodă de testare denumită polimorfismul lungimii
fragmentelor de restricţie (“restriction fragment length polymorphism” RFLP) în care ADN-ul
analizat este supus digestiei cu o enzimă de restricţie, iar fragmentele sunt analizate prin electroforeză
în gel. Modificările în secvenţa ADN-ului pot conduce la alterarea situsului de recunoaştere al enzimei.
Astfel, o alterare SNP poate introduce situsuri suplimentare, poate îndepărta situsurile de restricţie
existente, poate insera sau îndepărta secvenţe între situsurile de restricţie. Aceste alterări vor fi
reflectate în modificări ale mărimii benzilor vizualizate electroforetic .
6
În cazul determinării polimorfismelor genei VDR, în laboratorul nostru se foloseşte o reacţie de
polimerizare în lanţ urmată de analiza polimorfismului lungimii fragmentelor de restricţie (PCR-
RFLP):
- pentru polimorfismul Fok1 este amplificat un fragment ADN de 265 bp, care este apoi supus
digestiei cu ajutorul enzimei de restricţie FokI, rezultând în final 2 fragmente de 196 bp şi 69
bp atunci când situsul de restricţie este prezent;
- pentru polimorfismul B/b este amplificat un fragment ADN de 825 bp, care este apoi digerat
cu enzima BsmI, rezultând în final 2 fragmente de 175 bp şi 650 bp atunci când situsul de
restricţie este prezent .
4
Alte variante de teste PCR
◦ Nested PCR
Această tehnică a fost dezvoltată pentru a creşte atât sensibilitatea cât şi specificitatea testului PCR.
Sunt implicate două perechi de primeri şi două runde PCR. În mod caracteristic o pereche de primeri
este utilizată în prima rundă PCR alcătuită din 15-30 cicluri. Produşii de amplificare rezultaţi sunt supuşi

118