Page 120 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

testelor micro-IDent A şi micro-IDent B de identificare a germenilor asociaţi parodontitei etc .
4
◦ MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)
Constituie o variantă PCR care permite amplificarea mai multor ţinte (până la 40) cu ajutorul unei
singure perechi de primeri. În MLPA nu sunt amplificate secvenţe ţintă ale probei analizate ci sondele
oligonucleotidice care hibridizează specific la acestea. Amplificarea sondelor prin PCR depinde de
prezenţa în probă a secvenţelor ţintă din sondă.
Fiecare sondă este alcătuită din două oligonucleotide care hibridizează la situsuri adiacente ale
secvenţei ţintă. Una dintre oligonucleotide (stângă) conţine secvenţa recunoscută de primerul sens,
iar cealaltă oligonucleotidă (dreaptă) secvenţa recunoscută de primerul antisens.
Aceste oligonucleotide vor fi ligate (cu ajutorul unui ADN ligaze) într-o sondă completă permiţând
amplificarea ulterioară. Toate sondele ligate prezintă secvenţe terminale identice astfel încât pot fi
amplificate simultan cu o singură pereche de primeri.
Avantajul splitării sondei în două părţi constă în faptul că sunt amplificate doar oligonucleotidele ligate
nu şi cele libere. Dacă sondele nu ar fi splitate în acest mod, secvenţele recunoscute de primeri ar
determina amplificarea acestora indiferent dacă sunt hibridizate sau nu la matriţa ADN, iar produsul de
amplificare nu ar fi dependent de numărul situsurilor ţintă prezente în proba de ADN.
Fiecare sondă completă are o lungime unică astfel că ampliconii rezultaţi pot fi separaţi şi identificaţi
prin electroforeză capilară. Deoarece primerul sens este marcat cu un fluorocrom, fiecare amplicon va
genera un «peak» de fluorescenţă care poate fi detectat de secvenţiatorul capilar. Prin compararea
pattern-ului de fluorescenţă al probei analizate cu cel obţinut pe diferite probe de referinţă poate fi
determinată cantitatea relativă a fiecărui amplicon care se corelează cu procentul în care se găseşte
secvenţa ţintă în proba de ADN.
Aşa cum reiese din figura 5.6.1.11, etapele MLPA sunt următoarele:
- denaturarea ADN-ului ţintă şi hibridizarea sondelor MLPA;
- reacţia de ligare;
- reacţia PCR;
- separarea produşilor de amplificare prin electroforeză;
- analiza datelor.

120