Page 125 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE 5
AL LABORATOARELOR SYNEVO METODE DE LUCRU

Bibliografie
1. Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. In Nature, 1991;350(6313):91-2.
2. Frederick S. Nolte, Charles E. Hill. Polymerase Chain Reaction and Other Nucleic Acid
Amplification Technology. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory
Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007, 1239-1249.
3. Jan P. Schouten, Cathal J. McElgunn, Raymond Waaijer, Danny Zwijnenburg, Filip Diepvens
and Gerard Pals. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-
dependent probe amplification. In Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 12.
4. Laborator Synevo. Referinţe specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.
5. M. Tevfik. Real-Time PCR. Ref Type: Internet communication.
6. Martin Steinau, Margaret A. Piper, Elizabeth R. Unger. Molecular Diagnostics: Basic Principles
and Techniques. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods-
Sauders Elsevier 21-Ed 2007, 1228-1238.
7. RT-PCR in timp real. www.cantacuzino.ro

5.6.2 Secvenţierea acizilor nucleici

Acest termen se referă la metodele prin care este stabilită ordinea în care se succed bazele nucleotidice
AGCT într-o moleculă de ADN.
Scopul principal al analizei unei gene sau a întregului genom este de a determina secvenţa de baze
nucleotidice. Astfel, dezvoltarea în anii ’70 a unor metode relativ simple de secvenţiere a ADN-ului a
avut un mare impact asupra geneticii: metoda de clivaj chimic (A.M. Maxam şi W. Gilbert, 1977) şi o
metodă enzimatică (F. Sanger, 1981).
În prima metodă se utilizează clivajul specific cu anumiţi agenţi chimici, câte unul pentru fiecare bază.
Dimensiunile fragmentelor într-un amestec de reacţie sunt determinate de poziţiile pe care le ocupă
în molecula ADN baza nucleotidică care a fost clivată. Fragmentul ADN care trebuie să fie secvenţiat
este procesat pentru a se obţine o singură catenă, marcată la capătul 5’ cu un izotop radioactiv.
Această catenă de ADN este expusă la unul dintre cei patru agenţi chimici într-una din cele patru
reacţii. Cantitatea de agent chimic este limitată astfel încât va fi afectată în medie doar o singură
bază nucleotidică pe fiecare catenă, într-o poziţie aleatorie şi, de aceea, fragmentele rezultate în
urma clivajului vor avea mărimi diferite. Cele patru amestecuri de reacţie, câte unul pentru fiecare
bază, sunt supuse migrării electroforetice pe linii separate într-un gel de poliacrilamidă. Fiecare din
cele patru trasee reprezintă una din cele patru baze G, A, T sau C. Fragmentul cel mai mic va migra
cel mai departe, următorul va migra puţin mai aproape etc. Se va putea astfel citi secvenţa în direcţia
opusă migrării.
Cea de-a doua metodă, mai larg utilizată, se bazează pe principiul că sinteza ADN este oprită în
momentul în care locul unei deoxinucleotide normale (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) este utilizată

125