Page 124 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

Aplicaţiile în diagnostic: metodă alternativă pentru detecţia Neisseria gonorrhoeae şi Chlamydia
trachomatis în probe urogenitale. Avantajul reacţiei SDA este că, spre deosebire de PCR, poate fi
efectuată la o singură temperatură după reacţia de denaturare .
4
B. METODE DE AMPLIFICARE A SONDEI OLIGONUCLEOTIDICE
Metodele de amplificare a sondei diferă de cele în care este amplificată ţinta prin aceea că produşii
finali conţin o secvenţă care este prezentă doar în sondele iniţiale.
Un exemplu îl constituie reacţia de amplificare cu ligază (“ligase amplification reaction” LAR):
două sonde oligonucleotidice hibridizează adiacent una faţă de cealaltă pe una din catenele ADN-ului
ţintă denaturat; o ligază ADN termostabilă va alătura capătul 3’ al unei sonde de capătul 5’ al celeilalte
sonde; atât fiecare produs de ligare cât şi ţinta iniţială vor servi ca matriţă în ciclurile ulterioare de
denaturare, hibridizare şi ligare, având drept rezultat acumularea exponenţială de produşi.
C. METODE DE AMPLIFICARE A SEMNALULUI
În cazul acestor metode concentraţia ţintei sau a sondei nu se modifică; sensibilitatea analitică ridicată
rezultă din creşterea nivelului moleculelor marcate ce sunt ataşate de ţinta de acizi nucleici.
Un exemplu îl constituie sistemul “hybrid capture” ce se bazează pe o hibridizare în fază lichidă
(soluţie) cu detecţie prin chemiluminiscenţă. În laboratoarele noastre această tehnică se aplică la
detecţia tipurilor HPV cu risc crescut (oncogene). Ţinta ADN din probă este denaturată şi hibridizată
cu o sondă ARN specifică. Hibrizii ADN-ARN sunt captaţi de anticorpi specifici ce căptuşesc suprafaţa
unui tub. Se adaugă apoi un conjugat de anticorpi anti-hibrizi marcat cu fosfatază alcalină care
leagă hibrizii imobilizaţi. Conjugatul legat anticorpi-enzimă este detectat cu ajutorul unui substrat
chemiluminiscent, iar lumina emisă este măsurată într-un luminometru. Amplificarea semnalului
rezultă din numărul mare de situsuri de legare a anticorpilor precum şi din eficienţa reacţiei enzimă-
substrat. Intensitatea luminii emise este proporţională cu cantitatea de ADN ţintă din probă (vezi fig.
5.6.1.13) .
2
1. Denaturarea
2. Hibridizarea cu probei
sonda ARN HPV

5. Fosfatază alcalină
descompune substratul
3. Captarea hibrizilor 4. Se adaugă un al doilea chemiluminiscent care
în microplacă cu anticorp monoclonal va genera lumină
anticorpi monoclonali conjugat cu fosfatază
alcalină

Fig. 5.6.1.13 Tehnica Hybrid-Capture de detecţie a tipurilor HPV cu risc crescut
(Adaptare după www.papillomavirus.cz)

124