Page 127 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1
P. 127

GHIDUL  SERVICIILOR  MEDICALE                            5
                    AL  LABORATOARELOR  SYNEVO                  METODE DE LUCRU




        semnal albastru etc. Reacţiile de secvenţiere bazate pe stoparea sintezei lanţurilor în prezenţa unei
        dideoxinucleotide marcate fluorescent se desfăşoară automat în capilarele de secvenţiere. Migrarea
        electroforetică a fragmentelor ADN de mărimi diferite în gelul din capilare trece prin faţa unei raze
        laser concentrată într-o poziţie fixă. Laserul va induce un semnal fluorescent în funcţie de fluoroforul
        specific care reprezintă una din cele patru baze nucleotidice; software-ul ataşat converteşte semnalul
        fluorescent în date digitale. Astfel, în final, secvenţa ADN va fi citită şi înregistrată electronic, iar
        vizualizarea acesteia va fi sub forma unor peak-uri alternative colorate, corespunzătoare nucleotidelor
        care se succed în ordinea în care se găsesc în secvenţa analizată(vezi fig. 5.6.2.2). Secvenţa ADN
        obţinută este comparată cu o secvenţă de referinţă .
                                            1




                                                                    Rezultat













                  Fig. 5.6.2.2 Secvenţiere ADN automată cu dideoxinucleotide fluorescente
                      A.  Principiul secvenţierii automate
                      B.  Model de rezultat
         (Adaptare după Tom Strachan, Andrew P. Read. PCR, DNA Sequencing and In Vitro Mutagenesis.
                        In NCBI Human Molecular Genetics. www.nlm.nih.gov).

        Matriţele de ADN dublu catenar pot fi utilizate în reacţia dideoxi standard de secvenţiere, denaturarea
        ADN-ului  precedând  legarea  primer-ului  oligonucleotidic.  Cu  toate  acestea,  calitatea  secvenţelor
        obţinute din matriţele ADN iniţial dublu catenar este adesea inadecvată. Pentru rezolvarea acestei
        probleme se utilizează secvenţierea ciclică, denumită şi secvenţiere prin amplificare lineară, care
        constituie un fel de secvenţiere PCR. Ca şi în reacţia PCR standard, se utilizează o ADN polimerază
        termostabilă şi un ciclu care include etapele de denaturare, hibridizare şi sinteză a ADN-ului. Diferenţa
        constă în faptul că secvenţierea ciclică implică doar un singur primer şi conţine în plus o dideoxinucleotidă
        pentru stoparea sintezei lanţului ADN. Ca urmare a folosirii unui primer unic acumularea produşilor se
        produce linear şi nu exponenţial ca în reacţia PCR standard (vezi fig. 5.6.2.3). Deoarece produşii se
        acumulează în cursul reacţiei, iar temperatura la care se desfăşoară secvenţierea este ridicată, pot fi
        secvenţiate corespunzător cantităţi mici de plasmide dublu catenare, cosmide, λ DNA şi produşi PCR,
        fără a fi necesară o etapă de denaturare termică separată .
                                                 3
                                                                           127
   122   123   124   125   126   127   128   129   130   131   132