Page 127 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1
P. 127
GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE 5
AL LABORATOARELOR SYNEVO METODE DE LUCRU
semnal albastru etc. Reacţiile de secvenţiere bazate pe stoparea sintezei lanţurilor în prezenţa unei
dideoxinucleotide marcate fluorescent se desfăşoară automat în capilarele de secvenţiere. Migrarea
electroforetică a fragmentelor ADN de mărimi diferite în gelul din capilare trece prin faţa unei raze
laser concentrată într-o poziţie fixă. Laserul va induce un semnal fluorescent în funcţie de fluoroforul
specific care reprezintă una din cele patru baze nucleotidice; software-ul ataşat converteşte semnalul
fluorescent în date digitale. Astfel, în final, secvenţa ADN va fi citită şi înregistrată electronic, iar
vizualizarea acesteia va fi sub forma unor peak-uri alternative colorate, corespunzătoare nucleotidelor
care se succed în ordinea în care se găsesc în secvenţa analizată(vezi fig. 5.6.2.2). Secvenţa ADN
obţinută este comparată cu o secvenţă de referinţă .
1
Rezultat
Fig. 5.6.2.2 Secvenţiere ADN automată cu dideoxinucleotide fluorescente
A. Principiul secvenţierii automate
B. Model de rezultat
(Adaptare după Tom Strachan, Andrew P. Read. PCR, DNA Sequencing and In Vitro Mutagenesis.
In NCBI Human Molecular Genetics. www.nlm.nih.gov).
Matriţele de ADN dublu catenar pot fi utilizate în reacţia dideoxi standard de secvenţiere, denaturarea
ADN-ului precedând legarea primer-ului oligonucleotidic. Cu toate acestea, calitatea secvenţelor
obţinute din matriţele ADN iniţial dublu catenar este adesea inadecvată. Pentru rezolvarea acestei
probleme se utilizează secvenţierea ciclică, denumită şi secvenţiere prin amplificare lineară, care
constituie un fel de secvenţiere PCR. Ca şi în reacţia PCR standard, se utilizează o ADN polimerază
termostabilă şi un ciclu care include etapele de denaturare, hibridizare şi sinteză a ADN-ului. Diferenţa
constă în faptul că secvenţierea ciclică implică doar un singur primer şi conţine în plus o dideoxinucleotidă
pentru stoparea sintezei lanţului ADN. Ca urmare a folosirii unui primer unic acumularea produşilor se
produce linear şi nu exponenţial ca în reacţia PCR standard (vezi fig. 5.6.2.3). Deoarece produşii se
acumulează în cursul reacţiei, iar temperatura la care se desfăşoară secvenţierea este ridicată, pot fi
secvenţiate corespunzător cantităţi mici de plasmide dublu catenare, cosmide, λ DNA şi produşi PCR,
fără a fi necesară o etapă de denaturare termică separată .
3
127