Page 122 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

- o matriţă ARN este adăugată amestecului de reacţie (T7 ARN polimeraza, RNAzaH, AMV
revers transcriptaza, dNTP, soluţie tampon cu cofactorii enzimatici Mn , Mg );
2+
2+
- primul primer se ataşează secvenţei complementare la capătul 3’ al matriţei; capătul 5’ al
primer-ului conţine promotorul pentru T7 polimeraza;
- revers-transcriptaza sintetizează o copie ADN complementară (ADNc);
- RNAzaH distruge matriţa ARN (RNAza clivează selectiv numai ARN-ul hibridizat la ADN; nu
distruge ARN-ul monocatenar);
- al doilea primer se ataşează la capătul 5’ al lanţului de ADN; rezultă o moleculă ADNc dublu
catenară ce conţine un promoter T7 intact;
- polimeraza T7 transcrie fiecare catenă ADN într-o copie ARN.
Aceste etape reprezintă “faza non-ciclică a amplificării NASBA“. În continuare, în “faza ciclică a
amplificării NASBA”, fiecare moleculă ARN care este antisens faţă de ţinta iniţială va ataşa cel de-al
doilea primer şi va devini matriţă pentru revers-transcriptază (vezi figura 5.6.1.12).
Se vor sintetiza astfel noi matriţe ADNc, care la rândul lor vor genera mai multe matriţe ARN. Se poate
obţine după aproximativ 2 ore o amplificare de 10 ori a ţintei ARN .
9
1
Tehnica NASBA este aplicată în laboratorul nostru la detectarea ARNm pentru oncoproteinele E6/E7
al HPV .
4
5’ 3’
Faza aciclică Faza aciclica 5’ Reactia de hibridizare cu Primerul 11 3’
ReacĠia de hibridizare cu Primerul

Revers Transcriptaza Primer 1
Revers Transcriptaza
ARN Sinteza catenei complementare de ADN
Sinteza catenei complemenatre de ADN
3’ 5’
5’ 3’
ADN Degradarea ARN cu RNAzaH
ARN:ADN
Faza ciclică Faza ciclica Primer 2
Sinteza catenei de ADN
ADN:ADN Revers Transcriptaza

RNA polimeraza
ARN polimeraza + Primer 2
Fig. 5.6.1.12 Etapele reacţiei NASBA

III. Amplificarea izotermă SDA
Este o metodă de amplificare a ţintei care poate fi utilizată pentru detectarea unor nivele reduse de
secvenţe specifice ADN sau ARN.
În prezent reacţiile SDA se desfăşoară în 2 etape: generarea ţintei şi amplificarea exponenţială a
ţintei. În etapa de generare a ţintei matriţa de ADN dublu-catenar este denaturată şi hibridizată la două
perechi de primeri diferiţi, denumiţi primeri de amplificare şi primeri „tampon”. Primerii de amplificare

122