Page 123 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE 5
AL LABORATOARELOR SYNEVO METODE DE LUCRU

includ o secvenţă specifică enzimei de restricţie BsoB1 ce este situată la capătul 5’, în timp ce primerii
tampon sunt mai scurţi şi se leagă de secvenţa ADN ţintă, imediat în amonte faţă de regiunea de
amplificat.
În prezenţa BsoB1, o ADN-polimerază fără proprietăţi de exonuclează, şi a unui amestec de
deoxinucleotide: dATP, dGTP, dUTP şi dCTP tiolat (C ), sunt generaţi simultan produşii de elongaţie
s
(extensie) ai celor două tipuri de primeri. Acest proces „dislocă” produşii de ampificare care devin
astfel disponibili pentru hibridizarea cu primerii „tampon” şi de amplificare corespunzători catenei
antisens.
Extensia simultană a primerilor antisens generează catene complementare produşilor formaţi prin
extensia primilor primeri de amplificare având C încorporat la nivelul situsului de restricţie BsoB1.
s
Acest produs intră în faza de amplificare exponenţială a ţintei. Enzima BsoB1 recunoaşte situsul
dublu-catenar însă, deoarece o catenă conţine Cs, aceasta este mai degrabă „crestată” decât tăiată
de către enzimă. ADN polimeraza se leagă de „crestătură” şi va începe sinteza unei noi catene cu
dislocarea simultană a catenei în aval. Acest proces reface secvenţele dublu-catenare având situsul
de restricţie hemifosfotiolat, iar procesele de „crestare” şi „dislocare” se repetă. Catenele dislocate
sunt capabile să lege primerii antisens care vor genera ampificarea exponenţială a secvenţelor ţintă
(vezi fig. 5.6.1.13).
3’ 5’
MatriĠa ADN denaturată
5’ 3’ Legendă:
Ataúarea primerilor úi extensia
3’ 5’ Situsul enzimei
5’ 3’ de restrictie
3’ 5’
5’ 3’ Enzima
de restricĠie
Denaturare, hibridizare úi extensie ADN nou sintetizat
POL ADN
polimeraza
Digestia cu enzime de restricĠie
5’
5’
POL
POL

Fig, 5.6.1.13 Amplificarea SDA (Adaptare după Wolk, 2001)
Detecţia are loc simultan cu amplificarea; produşii de amplificare monocatenari se leagă de sondele
de detecţie real-time - molecule ADN monocatenare marcate cu fluoresceină şi rodamină. Regiunea
dintre cei doi trasori include o structură de tip ansă ce conţine situsul de restricţie pentru enzima
BsoB1. Secvenţa ţintă specifică este localizată într-o poziţie 3’ faţă de rodamină. În absenţa secvenţei
ţintă este menţinută structura de tip ansă cu cei doi trasori situaţi aproape unul de celălalt; emisia de
fluoresceină după excitaţie va fi redusă în acest caz. În prezenţa secvenţei ţintă, după reacţia SDA,
sonda este convertită într-o structură dublu-catenară ce poate fi tăiată de BsoB1, proces care produce
separarea fizică a fluoresceinei şi rodaminei, având ca efect creşterea emisiei semnalului generat de
fluoresceină .
2
123