Page 126 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

o dideoxinucleotidă (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP). O dideoxinucleotidă este un analog de
deoxinucleotidă căreia îi lipseşte gruparea hidroxil din poziţia 3’. Într-o primă etapă este iniţiată
sinteza ADN cu ajutorul unui primer, fiind adăugată alături de precursorii nucleotidici normali şi
una din cele patru dideoxinucleotide marcată cu P . În momentul în care apare în secvenţa ADN
32
baza corespunzătoare dideoxinucleotidei sinteza lanţului va fi stopată. Vor rezulta fragmente ADN
a căror mărime este determinată de poziţiile bazei nucleotidice în fragmentul ce trebuie secvenţiat.
Dimensiunile diferite ale fragmentelor ADN obţinute se datorează faptului că inserţia dideoxinucleotidei
se produce la întâmplare la una din numeroasele poziţii care pot accepta baza specifică. Cele patru
reacţii se desfăşoară în paralel, iar fragmentele sunt separate prin electroforeză la fel ca în metoda de
clivaj chimic (vezi fig.5.6.2.1).
ddGTP ddATP ddCTP ddTTP
Se adaugă ddGTP, ddATP, ddCTP,
ddTTP câte una în fiecare tub ce
conĠine ADN-ul Ġintă. Se încarcă fiecare
într-un traseu separat pe gel

Cea mai mare

Pentru secvenĠiere se va citi
ordinea de succesiune a
bazelor de la cea mai mică la
cea mai mare.
TCGAAGACGTATC

Cea mai mică

Fig. 5.6.2.1 Secvenţierea ADN conform metodei Sanger
(Adaptare după http://aska.biologists.asu.edu)

În momentul de faţă, pentru secvenţierea pe scară largă a ADN-ului se utilizează proceduri automate
bazate pe marcarea cu fluorofori şi folosirea unor sisteme performante de detecţie a fluorescenţei.
Astfel, pentru fiecare bază nucleotidică se utilizează câte un fluorofor. Semnalul fluorescent rezultat
este înregistrat într-un moment prestabilit, atunci când ADN-ul străbate un capilar ce conţine gelul de
electroforeză.
Fluoroforii specifici sunt ataşaţi dideoxinucleotidei corespunzătoare: de exemplu, ddATP este marcată
cu fluoresceină (culoare verde), ddCTP cu acid aminometilcumarin acetic (culoare albastră), ddTTP cu
rodamină (culoare roşie) şi ddGTP cu o combinaţie de fluorofori diferiţi (culoare neagră). Toate lanţurile
care se termină cu adenină (A) vor genera un semnal verde, cele care se termină cu citozină (C) un

126