Page 130 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

În centrul sistemului fuidic se plasează camera de flux cu trei secţiuni. În prima secţiune suspensia
celulară este injectată sub presiune cu ajutorul sistemului hidropneumatic în centrul unei teci de fluid
(sheath fluid), realizându-se o curgere coaxială, laminară. Cea de a doua secţiune este formată dintr-
un orificiu îngust (70 μm), iar la acest nivel se realizează practic focalizarea hidrodinamică a suspensiei
celulare. În ultima secţiune celulele sunt prezentate una câte una fasciculului de excitaţie .
5
Pe măsură ce celulele traversează fasciculul luminos de excitaţie, fiecare dintre acestea dispersează
lumina incidentă şi va emite, eventual, fluorescenţă.
Lumina dispersată este captată pe două direcţii: o direcţie paralelă cu cea a fasciculului incident -
lumina dispersată frontal (forward angle scatter, FS) şi o alta perpendiculară pe aceasta - lumina
dispersată lateral (90-degree light scatter sau side scatter, SS).
Lumina dispersată frontal oferă date cu privire la dimensiunea celulei sau a particulei analizate.
Lumina dispersată lateral oferă informaţii cu privire la complexitatea stucturii interne a celulei
(granularitatea citoplasmei, densitatea şi structura nucleului) şi neregularitatea suprafeţei celulare.
Emisia fluorescentă, în cazul celulelor marcate, este captată pe o direcţie perpendiculară faţă de cea
a fasciculului incident, separarea componentelor spectrale ale emisiei fluorescente efectuându-se cu
ajutorul filtrelor optice 1;2;5 .
Sistemul optic include cuprinde sistemul optic de excitaţie şi sistemul optic de colectare.
Sistemul optic de excitaţie conţine sursa luminoasă şi elementele optice de focalizare.
Sursa luminoasă trebuie să producă un fascicul de excitaţie cu o anumită intensitate şi lungime de undă,
astfel încât să stimuleze toţi fluorocromii atasaţi celulei şi să determine o dispersie detectabilă după
interacţiunea cu aceasta. Sursa de excitaţie luminoasă de tip laser furnizează lumină monocromatică
specifică şi variază în funcţie de aplicaţie (imunofenotipare, analiza cromozomilor, numărătoare de
reticulocite, detecţia de acizi nucleici etc.), de aceea lungimea de undă şi puterea laserului trebuie
corelate cu spectrul de excitaţie al fluorocromilor şi concentraţia acestora pe celulă .
5
Laserele pot fi pe bază de gaz (Ar, HeNe, Kr ), cu coloranţi organici - dye laser (rodamină, 570-640
nm), cu vapori de metal (HeCd), cu materiale semiconductoare (laser diode), cu mediu solid (solid
state laser).
În citometria în flux de uz clinic cele mai folosite lasere sunt: Ar (488 nm, lumină albastră), HeNe
(633 nm, lumină roşie), HeCd (dual 325, 442 nm, lumină ultravioletă şi albastră). Laserele diodice cu
emisii ce cuprind întreg spectrul, de la ultraviolet la infraroşu (spectrul luminii vizibile este cuprins între
400-700 nm) sunt folosite în special în cercetare .
5
Elementele optice de focalizare sunt reprezentate de lentile optice şi contribuie la realizarea unei
iluminări uniforme a fiecărei celule ce intersectează fasciculul laser; pe secţiune transversală fasciculul
luminos focalizat are formă eliptică .
5
Sistemul optic de colectare cuprinde filtrele optice, oglinzile dicroice şi detectorii, având rolul de a
conduce lumina dispersată şi semnalele de flourescenţă de la filtrele spectrale (optice) la detectori.
Filtrele optice realizează separarea luminii colectate în componente spectrale bine definite, aceasta
permiţînd analiza cantitativă a semnalelor de fluorescenţă, respectiv de dispersie. Lumina captată la
nivelul sistemului optic reprezintă o combinaţie a tuturor emisiilor fluorescente ce se datorează cuplării
specifice şi nespecifice a anticorpilor monoclonali, precum şi fenomenului de autofluorescenţă. Filtrele
sunt alese pentru a permite măsurarea semnalelor nefluorescente la aceeaşi lungime de undă ca a
semnalului de excitaţie (de ex. 488 nm), în timp ce canalele fluorescente sunt legate de semnalele de

130