Page 134 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

criterii:
- spectrul luminii absorbite trebuie să se suprapună cu lungimea de undă a luminii de excitaţie emisă
de un anumit tip de laser (de exemplu Ar, 488 nm);
- să aibă un coeficient de extincţie înalt (o măsură a probabilităţii absorbţiei unui foton de lumină);
- să aibă un randament cuantic (QY) înalt (o măsură a eficienţei conversiei luminii absorbite în lumină
emisă); de exemplu, RPhycoerythrin are un QY de 0.98 ceea ce înseamnă că fluorocromul emite un
foton pentru fiecare foton absorbit.
Intensitatea fluorescenţei unui fluorocrom este proporţională cu produsul dintre coeficientul de extincţie
şi randamentul cuantic.
Alte proprietăţi dezirabile sunt: interacţiunea slabă cu componentele celulare sau biologice şi
suprapunerea foarte redusă cu spectrul de emisie al altor fluorocromi .
4
Utilizarea mai multor markeri (anticorpi monoclonali) implică folosirea unor fluorocromi cu acelaşi
spectru de absorbţie, dar cu spectre de emisie diferite . 5
Fenomenul de compensare a fluorescenţei
Citometria de flux multicoloră este utilizată în studiul leucemiilor şi limfoamelor. Suprapunerea
spectrelor de emisie, în cazul folosirii simultane de fluorocromi, poate fi corectată prin folosirea unor
filtre adecvate şi alegerea atentă a fluorocromilor cu spectre de emisie îndepărtate. Fenomenul de
compensare constă în substragerea semnalelor de fluorescenţă de la detectorii care nu sunt potriviţi
pentru a detecta un anumit fluorocrom .
2
Principalii fluorocromi folosiţi pentru conjugarea cu anticorpii monoclonali sunt (vezi tabelul 1):
1. Fluorescein isothiocyanate (FITC): absorbţie maximă la 495 nm, emisie maximă la 520-530 nm;
3-6 molecule sunt folosite pentru conjugarea cu un singur anticorp monoclonal; sursa de excitatie:
laser Ar.
2. Phycoerythrin (PE): absorbţie maximă la 564 nm, emisie maximă la 576 nm; o singură moleculă
se foloseşte pentru conjugarea cu un anticorp monoclonal; sursa de excitaţie: laser Ar. Ca o regulă
generală, PE este în mod particular util pentru evaluarea markerilor slab pozitivi.
3. Texas red (TR): absorbţie maximă la 596 nm, emisie maximă la 620 nm; TR este excitat de un “dye
laser” (595-605 nm) sau Krypton laser (567 nm); se folosesc 3 molecule pentru conjugare; conjugarea
directă a acestui fluorocrom este instabilă şi în acest sens se recomandă folosirea BSA (albumină
serică bovină) ca şi carrier; în cazul folosirii combinate a fluorocromilor Texas red şi Phycoerythrin se
recomandă utilizarea unui citometru în flux cu 2 lasere, una dintre sursele de excitaţie fiind laser Ar.
4. Allophycocyanin (APC): absorbţie maximă la 650 nm, emisie maximă la 660 nm; sursa de excitaţie
este un “dye laser” (595-605 nm) sau HeNe laser (633 nm); o singură moleculă este conjugată cu un
anticorp monoclonal. APC este unul dintre cei mai folosiţi fluorocromi în procesele de sortare celulară
datorită coeficientului de absorbţie foarte mare, randamentului cuantic aproape perfect şi nivelului
foarte redus de autofluorescenţă.
5. Peridine chlorophyll protein complex (PerCP): absorbţie maximă la 490 nm, emisie maximă la 675
nm; sursa de excitaţie este laser Ar . 4
Fluorocromii în tandem sunt fluorocromi conjugaţi covalent şi doar unul dintre aceştia poate absorbi
lumina de excitaţie de 488 nm de la un laser Ar, cel mai folosit în cazul unui citometru în flux cu o
singură sursă de excitaţie luminoasă. Energia de la primul fluorocrom este transferată celui de-al
doilea, care nu poate fi excitat în mod direct la 488 nm, în schimb al doilea fluorocrom va emite o

134