Page 136 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

epitopul/determinantul antigenic.
Acurateţea imunofenotipării depinde atât de calităţile anticorpilor monoclonali, cât şi de proprietăţile
fluorocromilor.
Fenomenul de legare nespecifică a anticorpilor monoclonali se datorează fragmentului Fc, această
situaţie fiind întâlnită atunci când celulele de analizat prezintă receptori pentru Fc (celulele NK,
monocitele, neutrofilele, limfocitele B). Astfel, fenomenul de legare nespecifică se poate întâlni în
cazul probelor ce conţin celule maligne sau în cazul în care raportul fluorocrom/anticorp monoclonal
este mare. Fiecare anticorp monoclonal are un număr optim de molecule de fluorocrom care va emite
un maxim de fluorescenţă ca rezultat al legării specifice. Mărimea conjugatului anticorp monoclonal -
fluorocrom este deci importantă, conjugatele mari fiind insolubile, astfel că asocierea PE (240kd) cu
IgM (900 kd) nu este folositoare .
4
Metodă
Liza sângelui integral este tehnica cea mai comun utilizată pentru prepararea probelor şi constă în
mixarea unui volum fix de sânge total anticoagulat (sau măduvă osoasă) cu unul sau mai mulţi anticorpi
monoclonali conjugaţi, urmată de incubarea pentru un anumit timp şi la o anumită temperatură. Apoi
eritrocitele sunt lizate, proba este spălată şi analizată în citometrul în flux, fie cu celulele vii, fie după
fixarea cu paraformaldehidă. Cu celule fixate fluorescenţa şi dispersia luminii sunt stabile, iar obţinerea
datelor poate fi amânată zile sau săptămâni. Probabilitatea pierderii limfocitelor poate fi redusă prin
utilizarea tehnicilor de densitate-gradient pentru preparea celulelor mononucleare pentru analiză. Pot
fi analizate şi alte surse de celule cum ar fi lichidul de lavaj bronho-alveolar, aspirate pe ac fin etc.
Celule din ţesuturi solide, cum ar fi biopsie de cancer, pot fi utilizate dacă pot fi disociate şi dispersate
fără a sparge celulele.
Alegerarea reactivilor pentru imunofenoptipare depinde de celulele care trebuie studiate, dar este
recomandată includerea unui tub cu reactivi de “gating” (CD45 şi CD14) pentru confirmarea integrităţii
“gating”-ului limfocitar standard. În plus trebuie incluşi reactivi de control pentru stabilirea intensităţii
fluorescenţei celulelor negative. Un alt control important include un marker pan-celule T, celule B şi
celule NK pentru toate probele. Astfel procentul total de limfocite din “poartă” trebuie să fie aproximativ
egal cu suma celulelor T, B şi NK. De asemenea utilizarea mai multor markeri care identifică aceeaşi
populaţie celulară poate servi ca un control util (de ex. celulele T totale prin compararea CD3 şi CD5
sau CD2; celulele B totale prin compararea CD19 şi CD20) . 1

Bibliografie
1. Fleisher T, J B de Oliveira. „Flow cytometry”. În Clinical Immunology, Principles and Practice,
Rich R et al, 3rd Ed, Elsevier, 2008, 1435-37.
2. “Intro-to-Flow-Cytometry-notes”. www.healthsystem.virginia.edu. Flow Cytometry Core Facility,
University Virginia Health System.
3. Martz E, “Introduction to Flow Cytometry for Microbiology 542, Immunology Laboratory”. www.
bio.umass.edu. University of Massachusetts, Amherst MA US.
4. Paraskevas F. „Clinical Flow Cytometry”. În Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J,
Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11 ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 21-25.
th

136