Page 131 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE 5
AL LABORATOARELOR SYNEVO METODE DE LUCRU

emisie ale fluorocromilor specifici. Alegerea şi aranjamentul filtrelor permite analiza simultană a culori
(parametri) multiple(i) pentru fiecare celulă.
Există două tipuri de filtre:
● filtrele de absorbţie - absorb lungimile de undă nedorite şi permit trecerea celor de interes; sunt
fabricate din sticlă colorată şi ca rezultat al absorbţiei luminii aceste filtre au tendinţa de a emite
fluorescenţă;
●filtrele de interferenţă - permit selectarea precisă a lungimilor de undă prin atenuarea celor nedorite,

acest fapt fiind foarte important în cazul fluorocromilor cu spectre de emisie apropiate (ex. FITC/PE).
În cadrul filtrelor de interferenţă se disting următoarele tipuri: BP (“band pass”, 615-645 nm), LP (“long
pass”, > 500 nm), SP( “short pass”, < 500 nm) şi filtrele dicroice.
Oglinzile/filtrele dicroice sunt plasate la un unghi de 45° faţă de fasciculul de lumină şi sunt proiectate
pentru a reflecta lumina cu o lungime de undă sub o anumită valoare, în timp ce lumina cu lungime de
undă mai mare este transmisă frontal. Cu ajutorul filtrelor dicroice lumina fluorescentă este separată
progresiv în benzi cu lungimi de undă crescătoare ce corespund fluorocromilor folosiţi şi care sunt
reflectate la senzorii specifici (PMT).
Detectorii pentru lumina dispersată lateral şi pentru emisia de fluorescenţă sunt plasaţi perpendicular
pe direcţia fasciculului incident. Aceşti detectori pot fi tuburi de fotomultiplicare (PMT) sau fotodiode de
silicon. Fotodiodele sunt folosite în principal pentru detecţia luminii FS, iar PMT pentru detecţia luminii
SS şi a fluorescenţei. În mod tipic se folosesc 2-3 detectori care utilizează filtre pentru lungimi de undă
diferite ce permit detecţia simultană a emisiilor diferiţilor fluorocromi dintr-o singură celulă 2;3;4;5 .
Sistemul electronic
Sunt descrise trei etape de prelucrare a luminii dispersate şi a fluorescenţei emise de către particula
analizată: prelucrarea optică, conversia optico-electronică şi prelucrarea electronică a semnalului.
Etapa finală a analizei prin citometrie în flux presupune conversia semnalelor de natură electrică în
valori digitale care să poată fi prelucrate, stocate şi afişate de către computerul anexat sistemului.
Această conversie este realizată cu ajutorul convertorului analog-digital.
Detectorii convertesc fotonii în impulsuri electrice; emisiile de fluorescenţă au intensitate joasă şi de
aceea sunt necesare tuburile de fotomultiplicare.
Detectorii pot genera două tipuri de semnale electrice: semnale “peak” şi semnale integrale.
Amplitudinea semnalului “peak” depinde de relaţia dintre dimensiunea secţiunii transversale a
fasciculului de excitaţie şi diametrul particulei. Semnalele integrale sunt obţinute prin integrarea în timp
a semnalelor de tip “peak”, amplitudinea fiind proporţională cu aria aflată sub curba ce corespunde
acestora.
Un citometru de flux modern dispune de sisteme electronice ce pot realiza o amplificare liniară şi
logaritmică a semnalelor.
Amplificarea liniară este importantă în cuantificarea fluorescenţei ADN, ARN şi a luminii dispersate;
amplificarea logaritmică este necesară în imunofenotipare.
Fluorocromii care prezintă similitudini ale spectrului de absorbţie au şi un anumit grad de suprapunere
spectrală la emisie (ex. FITC/PE), în acest caz fiind necesară compensarea electronică a suprapunerii
spectrale 2;3;5 .
Există programe de analiză specializate, iar prezentarea datelor se face grafic sub forma histogramelor
(monoparametrice: axa x - abcisa reprezintă intensitatea fluorescenţei de la un singur fluorocrom

131