Page 115 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE 5
AL LABORATOARELOR SYNEVO METODE DE LUCRU

Sondele de hibridizare sunt de asemenea folosite pentru stabilirea genotipului mutaţiei, prin analiza
curbei de topire efectuată după încheierea ciclurilor de amplificare, când ampliconul este prezent în
concentraţii crescute.
Sonda marcată cu Red 640 hibridizează la o secvenţă a ţintei care nu conţine situsul mutaţiei (sondă
ancoră); sonda marcată cu fluoresceină hibridizează la o secvenţă care include situsul respectiv
(sondă a mutaţiei). În cursul analizei curbei de topire, creşterea semnificativă a temperaturii induce
scăderea fluorescenţei emise, deoarece sonda cu o secvenţa mai scurtă (sonda mutaţiei) este prima
care disociază şi cei 2 fluorofori nu mai sunt în apropiere. Dacă este prezentă mutaţia factorului V,
nepotrivirea sondei mutaţiei cu ţinta va destabiliza hibridul, astfel că scăderea fluorescenţei se va
înregistra la temperaturi mai joase. În prezenţa genotipului sălbatic (fără mutaţie), heteroduplexul ADN
este stabil şi va avea o temperatură de topire mai mare. Genotipul heterozigot prezintă o combinaţie
distinctă de proprietăţi.
Rezultatul pentru ADN-ul unei probe trebuie să prezinte întotdeauna un profil al curbei de topire pentru
unul din cele 3 genotipuri: tipul homozigot sălbatic (mutaţie absentă), mutant homozigot sau genotip
heterozigot. Dacă nu se produce acest lucru, testul va fi considerat invalid şi vor trebui repetate toate
etapele.
În plus, pentru validarea rezultatelor se folosesc 2 controale, negativ şi pozitiv, cu menţiunea că pentru
acesta din urmă trebuie să se obţină obligatoriu un profil de genotip heterozigot.
Pentru analiza mutaţiei protrombinei se foloseşte o metodă similară .
4
Detecţia ADN-ului pentru Chlamydia trachomatis (CT) şi Neisseria gonorrhoeae (NG) în probe
urogenitale
Testul include 4 procese majore:
- pregătirea probei;
- amplificarea ADN-ului ţintă cu ajutorul unor primeri specifici CT şi NG (oligonucleotide
marcate cu biotină);
- hibridizarea produşilor de amplificare la sonde oligonucleotidice specifice ţintei legate de
faza solidă a microplăcii;
- detecţia acestora printr-o metodă colorimetrică.
Etapa de pregătire a probei constă în extracţia ADN-lui ţintă din urină sau probe genitale recoltate pe
tampon uscat, printr-o tehnică manuală de tratare cu un detergent special.
Amplificarea se realizează într-un termocycler, iar detecţia pe un analizor ELISA automat.
Pentru monitorizarea acurateţii acestor 4 procese, se foloseşte un control celular reprezentat de o
secvenţă de ADN neinfecţios care conţine aceeaşi regiune de legare a primer-ului ca şi ADN-ul ţintă
şi care se va amplifica simultan cu acesta.
După amplificarea PCR, detecţia ampliconilor biotinilaţi este efectuată cu ajutorul unor sonde
oligonucleotidice specifice care permit identificarea separată a ampliconului ţintă şi a celui
corespunzător controlului celular. Cantitatea de biotină captată la nivelul godeurilor microplăcii este
direct proporţională cu cantitatea de ampliconi produşi în fiecare probă. După o etapă de spălare
se adaugă un conjugat de streptavidină (ce are o afinitate foarte mare faţă de biotină) cuplat cu o
enzimă (peroxidază). Această ultimă fază este similară procedurii testelor imunoenzimatice, în care
peroxidaza în asociere cu peroxidul de hidrogen generează un produs colorat dintr-un substrat incolor
(tetrametilbenzidină). Produsul final de reacţie este măsurat fotometric.

115