Page 111 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE 5
AL LABORATOARELOR SYNEVO METODE DE LUCRU

- prin electroforeză în gel de agaroză: fragmentele ADN amplificate pot fi separate pe baza greutăţii
moleculare prin electroforeză în gel; agaroza constituie mediul de separare cel mai frecvent utilizat
de obicei în asociere cu un pat electroforetic orizontal în care gelul este imersat într-un tampon
(“submarine gel”); probele sunt pipetate în godeuri separate la un capăt al gelulului; după aplicarea
unui voltaj probele de ADN migrează către electrodul pozitiv într-un mod linear, fiecare godeu cu
probă formând o linie de migrare; vizualizarea benzilor separate prin electroforeză este realizată prin
colorare cu bromură de etidiu (un colorant fluorescent al ADN-ului conţinut în gel care se intercalează
între perechile de baze azotate) şi expunere la lumină ultravioletă într-un transiluminator; pentru
evaluarea mărimii fragmentelor analizate se foloseşte un marker de greutate (“DNA ladders”) - un
amestec de acizi nucleici cu greutate cunoscută a fragmentelor componente - care este analizat
electroforetic împreună cu probele; compararea distanţei de migrare a probelor cu cea a marker-
ului de greutate permite determinarea mărimii acestora ; detecţia electroforetică a acizilor nucleici
6
este utilizată în laboratorul nostru pentru depistarea mutaţiilor asociate cu hemocromatoza ereditară
clasică, a mutaţiilor genei MTHFR, tipajul HLA, analiza polimorfismelor B/b şi Fok1 la nivelul genei
receptorului vitaminei D etc .
4
Vom detalia în continuare modul de aplicare a metodei PCR la determinarea unora dintre testele mai
sus menţionate:
Determinarea încărcăturii virale B plasmatice
Iniţial în laboratorul nostru a fost utilizată tehnologia convenţională PCR pentru determinarea viremiei
B sau C, însă în momentul de faţă se recurge la tehnologia real-time PCR Taqman cu prelucrarea
automată a probelor. Particularitatea o constituie metoda de detecţie a produsului PCR, care este
cuantificat în cursul desfăşurării reacţiei (‘în timp real”) prin monitorizarea fluorescenţei emise la
fiecare ciclu de amplificare, spre deosebire de detecţia colorimetrică care avea loc la sfârşitul reacţiei,
în tehnologia convenţională .
4;5
Testul de determinare a viremiei VHB se bazează pe 2 procese majore:
- pregătirea probei pentru a izola ADN-VHB;
- amplificarea PCR a ADN-ului ţintă cu detecţia simultană a sondei oligonucleotidice dublu marcate
clivate specifice ţintei.
Cuantificarea viremiei se realizează cu ajutorul unei secvenţe ADN neinfecţioase denumită Quantitation
Standard (QS). ADN QS cu un număr cunoscut de copii este adăugat în fiecare probă şi parcurge
aceleaşi etape de preparare a probei, amplificare PCR şi detecţie ca şi secvenţa ţintă. QS conţine
secvenţe VHB cu zone identice de legare a primerilor ca şi ADN-ul ţintă, dar cu o zonă unică de
legare a sondei de detecţie care permite diferenţierea ampliconului QS de ampliconul ţintei. Analizorul
calculează concentraţia ADN-VHB prin comparararea semnalului ţintei cu semnalul QS din fiecare
probă şi controale.
Extracţia acizilor nucleici se face automat printr-o tehnică de captură la suprafaţa unor biluţe
magnetice de sticlă. Particulele virale sunt lizate prin incubarea la temperatură ridicată cu o protează
şi un tampon care eliberează acizii nucleici şi îi protejează de acţiunea DNA-zelor din plasmă. În
fiecare probă este introdus ADN QS într-o concentraţie cunoscută, împreună cu proteaza, agentul
lizant şi biluţele de sticlă. După ce are loc incubarea amestecului, ADN VHB şi ADN VHB QS
vor fi captate la suprafaţa biluţelor de sticlă, în timp ce subsţantele nelegate vor fi îndepărtate
printr-un proces de spălare. După încheierea etapei de spălare, acizii nucleici adsorbiţi vor fi eluaţi

111