Page 106 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

FISH combină tehnicile de citogenetică cu cele moleculare pentru a detecta secvenţe specifice de ADN
sau ARN în celule, ţesuturi şi tumori; constă în cuplarea unor lanţuri monocatenare de acizi nucleici pe
baza existenţei unor secvenţe complementare, cu formarea de complexe sau hibrizi. Prin hibridizarea
acizilor nucleici poate fi determinat gradul de identitate al secvenţelor şi localizarea acestora pe
cromozom. Practic, o sondă marcată fluorescent hibridizează cu secvenţa ţintă complementară,
rezultatul cuplării fiind vizualizat în microscopie cu fluorescenţă.

Etapele de desfăşurare a reacţiei:
1. fixarea specimenului pe lame de microscop (pot fi utilizate celule în metafază pregătite
la fel ca pentru analiza clasică a cariotipului sau celule în interfază pentru care nu este
necesară efectuarea culturii);
2. denaturarea ADN-ului şi hibridizarea sondei marcate fluorescent la fragmentul genomic
omolog, utilizând o temperatură adecvată;
3. detectarea hibridului fluorescent (vezi figura 5.5.3).

FISH
FISH
… . …. . SecvenĠa (sonda) )
….
…
n
(
S
d
n
e
a
a
o
s
e
c
v
Ġ
m
o
z
C
Cromozom pe lamelă ă c complementară r ă
o
r
o
m
a
l
e
p
m
l
e
p
e
n
o
a
l
m
em
t
G

C

T
T

T C A T G A A m a r c a t ă c u
A
marcată cu
C

G

T

A

….
…. . A A G T A C T T … . f fluorofor r
f
o
o
u
…
o
l
r
u
r
a
e
t
D Denaturare r e
n
a
a
l
u
n
a
t
c
a
D
n
e
LanĠ dublu catenar ADN N
L
d
u
b
A
Ġ
r
…
…. . …. . T G
…
T G
C A

G
T

T
T C A T G A A T T C A

C
A

C

T

G
A

…
….
… . A A G T A C T T …. . H Hibridizarea cu ADN denaturat a t
a
a
e
u
t
a
D
d
n
u
e
N
r
r
c
d

i
r
i
b
A
z
i
a
e
n
a
r
u
D Denaturare r e
t
…
….
…
…
…. . … . …. . …. .
C
A

G

G

T

T

A

C
T T C A T G A A T T C A T G A A

T

G

C
A
A

A
C
A

G

T

A

T

C

G

…. . A G T A C T T …. . … . A A G T A C T T … . …. . A G T A C T T … .
…
…
….
…
….
….
Fig. 5.5.3 Etapele reacţiei FISH
(Adaptare dupa www.zum.de/Faecher/Materialien/beck/bilder/fish)

Marcarea sondelor cu fluorofori oferă rezultate cu o rezoluţie mult mai mare într-un timp mai scurt, în
comparaţie cu folosirea în trecut a izotopilor.
Secvenţele repetitive din proba de analizat sunt blocate prin adăugarea unor sonde scurte de ADN;
sonda esta aplicată fragmentului de ADN cromozomial de analizat şi incubată pentru hibridizare
timp de 12 ore. După mai multe spălări pentru îndepărtarea fragmentelor nehibridizate sau parţial
hibridizate rezultatele sunt vizualizate şi cuantificate cu ajutorul microscopului cu fluorescenţă. Gradul
de fluorescenţă depinde de eficienţa marcării cu fluorofori.
Marcarea directă cu flourocromi a sondelor este utilizată pentru a detecta ţinte ADN mari deoarece
106