Page 116 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

Un rezultat negativ pentru o probă este validat numai dacă se obţine un rezultat pozitiv pentru controlul
celular .
4
Genotiparea HPV
În cazul acestui test amestecul de reacţie conţine primeri pentru amplificarea ADN a 37 genotipuri
HPV precum şi a genei β-globinei (control celular). Pentru detecţie şi genotipare se utilizează un ADN
amplificat denaturat şi stripuri care includ sonde oligonucleotidice dispuse liniar (sub formă de benzi)
care permit identificarea independentă a genotipurilor HPV individuale. Astfel, după hibridizare stripul
va fi spălat pentru a îndepărta orice material nelegat. Conjugatul (streptavidină cuplată cu peroxidază)
adăugat în etapa următoare se va lega de ampliconul marcat cu biotină şi hibridizat la sondele specifice
din strip. După o etapă de spălare care îndepărtează conjugatul nelegat se va adăuga substratul
ce conţine peroxid de hidrogen şi TMB; în prezenţa peroxidului de hidrogen, peroxidaza legată de
amplicon va cataliza oxidarea TMB cu formarea unui compus colorat in albastru care va precipita în
poziţiile sondelor unde s-a produs hibridizarea. Stripul este apoi citit cu ochiul liber prin compararea
pattern-ului de benzi albastre cu cel ilustrat în strip-ul de referinţă .
4
Detectarea mutaţiilor C282Y şi H63D la nivelul genei HFE (asociate cu hemocromatoza clasică)
Într-o primă etapă sunt amplificate specific ambele alele ale genei HFE după care produşii de
amplificare sunt detectaţi prin electroforeză în gel de agaroză.
Dacă ambele alele pentru C282Y prezintă secvenţa sălbatică (genotip homozigot de tip sălbatic) gelul
de agaroză va conţine o singură bandă specifică de 250 bp. Dacă o alelă prezintă secvenţa de tip
sălbatic, iar cealaltă alelă secvenţa de tip mutant (genotip heterozigot) vor fi vizualizate 2 benzi: de
250 bp şi respectiv 290 bp. Dacă ambele alele prezintă secvenţa mutantă (genotip homozigot mutant)
va apărea pe gel o singură bandă de 290 bp.
În cazul mutaţiei H63D mărimea benzilor obţinute este de 190 bp pentru tipul sălbatic şi 230 bp pentru
tipul mutant. Controlul pozitiv al reacţiei este reprezentat de genotipul heterozigot (vezi fig.5.6.1.7).

Mutaţie C282Y Mutaţie H63D
Control Control Proba Proba Proba Control Control Proba Proba Proba
Negativ Pozitiv 1 2 3 Negativ Pozitiv 1 2 3
HZ MU WT WT HZ WT MU WT

Fig. 5.6.1.7 Genotipuri HFE
WT = homozigot sălbatic HZ = heterozigot MU = homozigot mutant

116