Page 134 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 3

18 TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

mai mare de răspuns pe termen lung şi cu îmbunătăţirea perioadei de supravieţuire fără progresia bolii
(PFS = progression-free survival) la pacienţii trataţi cu Imatinib. Astfel, în studiul IRIS toţi pacienţii cu
MMR la 12 luni de la începutul tratamentului nu au prezentat nici un semn de fază accelerată sau criză
blastică la evaluarea efectuată la 60 luni. Este important de menţionat faptul că în acest studiu a fost
evitată folosirea termenului de „răspuns molecular complet“ fiind determinat numai numărul pacienţilor
la care s-a obţinut un rezultat nedetectabil al produşilor de transcripţie cu o sensibilitate analitică
de 4.5 log sub valoarea bazală standardizată. Deoarece un rezultat nedetectabil reflectă limita de
detecţie a metodelor actuale, acesta nu trebuie considerat o dovadă de eradicare a bolii .
16
Având în vedere importanţa clinică a evaluării prezenţei bolii minime reziduale au fost iniţiate mai
multe eforturi de a standardiza cuantificarea BCR-ABL. În acest sens, un grup de experţi a propus la
întâlnirea internaţională de consens de la Bethesda (2005) ca măsurătorile BCR-ABL să fie exprimate
pe o scală internaţională (IS) care foloseşte două valori standard: valoarea bazală standardizată
(stabilită în studiul IRIS) considerată ca fiind 100% pe IS şi valoarea MMR standardizată considerată
ca fiind 0.1% pe IS (corespunde unei reduceri cu 3 log faţă de valoarea bazală). O valoare de 1-2%
IS corespunde în linii mari cu limita de detecţie a metafazelor Ph1-pozitive prin examenul citogenetic
standard. O valoare < 0.1% IS indică răspunsul molecular major (MMR) .
11
Recomandări pentru efectuarea testului
● diagnosticul LMC şi LAL Ph pozitive;
● monitorizarea răspunsului molecular la tratament şi stabilirea prognosticului;
● detectarea bolii minime reziduale . 8
Specimen recoltat - a) sânge venos; b) aspirat medular .
9
Recipient de recoltare - a) şi b) vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant .
9
Cantitate recoltată - a) 3-5 mL; b) 3 mL (minimum 1 mL) .
9
Cauze de respingere a probei - folosirea heparinei ca anticoagulant . 9
Stabilitate probă - maximum 3 zile la 2-8ºC .
9
Metodă - se folosesc două tipuri de testări:
Detecţia calitativă a produşilor de transcripţie ARNm BCR-ABL1 (în scop diagnostic)
Include următoarele etape:
- izolarea şi purificarea ARN-ului;
- reacţia de revers transcriptie (RT-PCR) pentru obţinerea ADN-ului complementar (ADNc)
folosit ca matriţă pentru amplificarea PCR;
- multiplex PCR (detecţia uneia sau mai multor secvenţe ADN ţintă în amestec prin folosirea
unuia sau a mai multor seturi de primeri oligonucleotidici) + două nested-PCR optimizate
pentru detectarea diferitelor puncte de ruptură din genele BCR şi ABL;
- fiecare rulare a probelor este însoţită de o reacţie de control cu ADNc de la o linie celulară
cu translocaţia t(9;22) şi o reacţie de control negativ cu ADNc al unei linii celulare care
nu prezintă translocaţia; pentru controlul calităţii ARN din probă şi a eficienţei reacţiei de
revers-transcripţie se utilizează în paralel o amplificare RT-PCR a unui fragment ADNc al
genei ABL umane;
- detecţia produşilor PCR prin electroforeză în gel de agaroză;
- limita de detecţie a testului este de cel puţin 1 celulă LMC la 100 000 celule normale 1;7;9 .
Detecţia cantitativă a produşilor de transcripţie ARNm BCR-ABL1 (în scop de monitorizare)

134